TINCIÓN DE GRAM

TINCIÓN DE GRAM

OBJETIVO:

Diferenciar las bacterias en Gram (+) y Gram (-) en función de la distinta composición de su pared bacteriana.

MATERIAL

• Mechero Bunsen 
• Portaobjetos 
• Asa de platino 
• Pipeta Pasteur 
• Colorantes de Gram (cristal violeta, lugol, alcohol - acetona, safranina ) 
• Agua destilada estéril 
• Cristalizador, barras paralelas, frasco lavador, microscopio 
• Muestra de material clínico o cultivo bacteriano.

Extensión: 

1. Colocar en un portaobjetos limpio, seco y desengrasado, una gota de SSF estéril utilizando el asa de platino previamente esterilizada. 
2. Tomar asépticamente con el asa una pequeña muestra del cultivo sólido y mezclar con la gota de SSF para obtener una suspensión. 
3. Extender la suspensión con el asa de platino previamente esterilizada y enfriada.

NOTA: Es importante que la preparación sea fina: – Si se pone demasiada muestra, el frotis quedará muy grueso (se observará una gran mancha coloreada). En el microscopio, con el objetivo de inmersión, se observará una masa oscura de estructuras que no pueden distinguirse de forma individual y por tanto se dificulta el proceso observación e identificación.

Desecación: 

La preparación se deja secar, a temperatura ambiente o calentando muy suavemente

Fijación: 

La muestra, una vez extendida y seca

Debe fijarse utilizando calor. Esto se consigue pasando el porta, tres veces, por la llama del mechero.Se debe tener cuidado de no calentar mucho el portaobjetos.
NOTA: Si la extensión bacteriana no se fija adecuadamente, las bacterias se pierden durante los sucesivos lavados y solo se observará la ausencia de bacterias teñidas. 
• Por el contrario, un sobrecalentamiento del porta, durante esta fase, puede ocasionar la aparición de artefactos y la ruptura de la morfología de las células bacterianas.

Coloración: Las extensiones, ya fijadas, se sitúan sobre unas paralelas colocadas en una bandeja o cristalizador y se procede a realizar la tinción de Gram:

1. Cubrir la preparación con cristal violeta (colorante primario) durante 1 min y lavar con agua destilada ligeramente

1. Lugol (mordiente que acentúa la penetración del colorante primario) durante 1 min- lavar con agua destilada ligeramente.

1. Decoloración con alcohol-acetona (15 a 20 segundos). Este reactivo solo arrastra el colorante en las bacterias G (-)- lavar con abundante agua para que no queden restos de alcohol.

1. Colorante de contraste: cubrir con Safranina (1 min y 30 seg) la cual tiñe de rojo a las bacterias decoloradas, es decir las G(-) que tienen una pared celular fina

1. Lavar con agua en abundancia y secar .