Pruebas de identificación bacteriana
Pruebas bioquímicas de identificación de Bacilos Gram (-)
Kligler
Curiosidades:
- Diferenciación de enterobacterias
- Medio sólido diferencial.
- Se prepara en slant
- Contiene: lactosa (1,0%), glucosa (0,1%), peptona(20g) y un indicador de pH (rojo fenol)que vira a marillo cuando el pH es ácido y a color rojo más intenso (rojo cereza) cuando el pH es alcalino.
- En condiciones anaerobias (fondo del tubo)
- En condiciones aerobias (superficie inclinada)
- Ambos hidratos de carbono (glucosa y lactosa)
- Solo la glucosa (lactosa negarivos)
- No fermentan ni la glucosa ni la lactosa.
Producto de gas
- Producción de ácido sulfhídrico.
Procedimiento
1.Cogemos el medio Kligler
2.Se toma una colonia de la muestra y se siembra en picaduraen el fondo del tubo y a continuación se siembra en estria sobre la superficie del pico de flauta
3.Incubamos a 37ºC durante 24 h.
NOTA: nosotros lo dejamos todo el finde.
Lectura de los resultados:
- No forma gas, ya que no se observan ni burbujas, ni grietas o desplazamiento del fondo del tubo.
- Lactosa y glucosa positiva, por la observación de manchas amarillas.
- Sulfídrico positivo por la observación del precipitado negro.
IMVIC
Conjunto de cuatro pruebas bioquímicas para la identificacion bacteriana:
INDOL
Fundamento
- Identificar bacterias que producen el enzima triptonasa y por tanto son capaces de producir indol a partir del aminoácido triptófano (presente en el medio)
- El indol se visualiza con el reactivo de Kovacs, que provoca la formación de un anillo rojo en el tubo.
Procedimiento:
1.Se coge un caldo de peptona (1% de peptona, 0.5 % de CLNa), envasado en tubos y esterilizado en el autoclave.
2.Se inocula una colonia de la muestra en el tubo con el medio de cultivo.
3.Incubamos a 37ºC/ 24 horas
NOTA: nosotros lo dejamos todo el finde
4.Se añade varias gotas de reactivo de Kovacs (de color amarillo) que al ser menos denso que el caldo de peptona o triptona queda sobre la superficie de este formando una especie de anillo:Rojo-morado si es positiva o amarilla si la reacción es negativa.
Lectura de los resultados:
La prueba es negativa ya que sale un color amarillento.ROJO DE METILENO
Fundamento:
Identificar a las enterobacterias, que son microorganismos anaerobios facultativos, que pueden metabolizar la glucosa por:
- Vía aerobia (respiración) consumiendo rapidamente el oxigeno del medio.
- Vía anaerobia (fermentación) Que puede ser de 2 tipos dependiendo de los productos finales obtenidos: ácido-mixta o butilen glicólica
- La prueba del rojo de metileno estudia la capacidad de las bacterias para metabolizar la glucosa por la via de fermentación ácido-mixta, en la vcual se produce ácidos estables(acético, fórmico, etc-), relativamente fuertes que bajan el pH del medio hasta 4-5.
- El descenso de pH se puede detectar añadiendo, al cultivo, un indicador como el rojo de metileno.
Procedimiento:
1. Se coge un medio líquido de Clrk-lubs
2. Se inoculan las colonias bacterianas
3.Se incuban a 37ºC 24 h
NOTA: nosotros lo dejamos todo el fin de semana.
4. Se añaden varias gotas de solución alcohólica de rojo de metilo al 0.04%
Lectura de los resultados:
Es positivo, pues se desarrolla un color rojo estableVOGES-PROSKAUER (VP)
Fundamento
- Identifica a la enterobacterias
- Estudia la capacidad de las bacterias para metabolizar la glucosa por la via de la fermentación butilen glicólica (o butanodiólica), en la cual se forma acetoina (acetilmetilcarbinol) que es producto intermedio en la producción de butanodiol.
- La acetoina puede ser detectada añadiendo, al medio, alfa-naftol y KOH al 40% que reraccionaran con este compuesto produciendo un color rojo característico.
Procedimiento
1. Se coge un medio de Clark-Lubs2.Se inoculan las colonias bacterianas
3.Se incuban a 37ºC durante 24 horas.
NOTA: nosotros lo dejamos todo el fin de semana.
4.Se añaden 3 gotas (0.6ml) de solución de alfa-naftol, agitamos y añadimos KOH al 40% (0.2ml) Agitar y observar a los 15 min.
NOTA: nosotros lo dejamos todo el fin de semana.
4.Se añaden 3 gotas (0.6ml) de solución de alfa-naftol, agitamos y añadimos KOH al 40% (0.2ml) Agitar y observar a los 15 min.
Lectura de los resultados:
Es negativa pues no se desarrolla un color rojo-fucsia.
CITRATO
Fundamento
- Identificar a las enterobacterias
- Determinar la capacidad que tienen algunos microorganismospara usar el citrato como única fuente de carbono.
- Esta reacción es llevada a cabo por la enzima citrasa.
- El citrato se produce en el ciclo de klebs, pero algunos organismos son capaces de usarlo como única fuente de carbono, cuando no hay carbohidratos fermentables en el medio
- Cuando el citratoi entra en la célula se hidrolizan, mediante la citrasa, en ácido oxalacético y ácido acético.
- El ácido oxalacético se hidrolarizará a su vez n ácido pirúvico y CO2. Este último dará lugar a la formación de productos alcalinos.
- El medio agar citrato de Simmons contiene:
- Citrato sódico como única fuente de carbono
- Ión amonio como única fuente de nitrógeno
- Azul de bromotimo como indicador de pH.
- El medio inicialmente es de color verde pero cuando el microorganismo utiliza el citrato se forman productos alcalinos que aumentan el pH del medio (> pH 7.6) causando el viraje del indicador (azul de bromotimol) contenido en el medio que pasa de verde a azul.
Procedimiento
1.Se siembra en la superficie inclinada del tubo con agar citrato Simmons.
2. Se incuban los tubos durante 24 h
NOTA: nosotros lo dejamos todo el fin de semana.
NOTA: nosotros lo dejamos todo el fin de semana.
Lectura de los resultados:
Resultado positivo, se produce un cambio de color de verde a azul.
TEST DE LA UREA
Fundamento
- Diferfenciar a los microorganismos capaces de hidrolizar la acción del enzima ureasa (por ejemplo Proteus)
- Este enzima al hidrolizar la urea (H2N-CO-NH2) origina amoniaco, el cual produce un incremento del pH del medio que puede detectarsemediante un indicador (rojo fenol)
Procedimiento
1.Se realiza sobre un medio que lleva urea y un indicador de pH (rojo fenol), que por encimade pH 8.4 vira de amarillo a rosa S.
2.Se puede utilizar:
Un medio sólido, en pico de flauta, contenido en un tubo, como puede ser Agar urea de Christensen
O un medio líquido como el caldo urea indol.
La urea es termolabil y no puede esterilizarse en el autoclave, por lo que se recurre a la filtración
Las bacterias (sew topma gran cantidad) se inoculan en el medio líquido o se siembra en la superficie inclinada del medio sólido. S e incuban los tubos a 37ºC, se observa el viraje de color del medio a las 24 h
NOTA: nosotros lo dejamos todo el fin de semana.
Lectura de los resultados:
Es positivo, pero era positivo desde antes de cultavarlo.
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